Colletotrichum trifolii

Nom binominal

Colletotrichum trifolii
Bain, 1906

Colletotrichum trifolii est une espèce de champignons microscopiques de la famille des Phyllachoraceae qui s'attaque à la Luzerne et provoque une maladie connue sous le nom d'anthracnose de la luzerne.

COLLETOTRICHUM trifolii est un champignon pathogène de la luzerne, causant l’anthracnose de luzerne de maladies des plantes. C’est un biotroph, obtention des nutriments de la vie cellules végétales avant de former asexuée des spores. Ce champignon possède deux races connues Bain et Essary.

Hôtes et symptômes

Hôtes

COLLETOTRICHUM trifolii est un pathogène de nombreuses cultures fourragères. Ceux-ci incluent :

• Luzerne (plus fréquent)
• Le mélilot
• Trèfle de Burr
• Trèfle souterrain
• Trèfle incarnat

Symptômes

Ce pathogène provoque l’anthracnose chez ces plantes. Les symptômes visuels incluent :

• Dispersés de paille plantes colorées dans le domaine
• Jaunissement des feuilles
• Formation d’un « escroc de bergers »
• Lésions brun grisâtres sur le tronçon inférieur menant à la pourriture du collet

Une fois parties des parties végétales mourir des feuilles tournera à faire bronzer le noir corps de Colletotrichum trifolii particulièrement visible à l’observateur de la fructification. 

Environnement

Anthracnose du Colletotrichum trifolii affecte plus gravement les cultures à l’est du Mississippi et au sud du Wisconsin. On trouve aussi en Californie et en Arizona méridional et dans les cas moins graves, Colletotrichum trifolii a une pression modérée à travers les États-Unis entiers sauf autour des montagnes Rocheuses. ^[4] on trouve aussi en Europe, Amérique du Sud et au Canada. ^[5] ce pathogène développe le mieux autour de 25 ° C. COLLETOTRICHUM trifolii également besoins humidité importante pendant au moins douze heures pour infecter la plante bien qu’après avoir été infecté il peut survivre sur la plante par temps sec. 

Gestion

Il y a seulement deux manières de gérer le Colletotrichum trifolii. La première consiste à commencer tout de suite au début de l’été du Scoutisme. Si ce pathogène se trouve dans une rotation de grandes cultures dans le domaine des cultures fourragères au moins deux ans. Une autre méthode de gestion est plantée des variétés résistantes. Il est recommandé de planter seulement les variétés à une cote minimale de résistance modérée mais si Colletotrichum trifolii a été un problème dans le passé ne planter des cultivars très résistants. ^[6] la dernière tactique de gestion consiste à retarder la plantation jusqu’après le Colletotrichum trifolii est normalement un problème. Cela signifie attendre la fin de l’été, autour d’août, cela permet aux plantes de devenir un bon peuplement pendant la fin de l’été et l’automne tout en échappant la plupart du temps lorsque l’agent pathogène est répandu, cette méthode n’est pas très pratique surtout avec les variétés résistantes d’aujourd'hui.

Identification

Identification au microscope optique après grattage au niveau des fructifications des lésions de base de tiges. Isolement sur milieu nutritif artificiel.

Description

Les parcelles touchées présentent des tiges flétries, dispersées ou en foyers.
A la base des tiges, sur plantes isolées, taches beiges, fusiformes bordées de brun-noir dont le centre devient gris clair ponctué de brun foncé.
La tache peut entourer entièrement la tige qui se dessèche et se courbe en crosse au sommet.
En été les plantes se dessèchent.

Biologie

Conservation du champignon à l'état de mycélium dans les débris végétaux ou dans les collets de Luzerne malades encore en place.
Les conidies apparaissent à la base des tiges, dans une gelée tapissant des stromas mycéliens (acervules).

Epidémiologie

Les acervules apparaissent lors de fortes humidités et à une température d'environ 20 C.
La dissémination des conidies se fait par la pluie.
Les conidies germent en l'espace de 6 à 8 heures à la température de 25 C.
Des cycles d'infection secondaire sont possibles si les conditions d'humidité et de température restent favorables.

Traitement

Effectuer une coupe précoce qui réduit l'humidité dans la culture.
Utiliser des cultivars résistants.

Confusion possible

Les symptômes de flétrissement peuvent être confondus avec ceux de Sclerotinia trifoliorum, Verticillium albo-atrum, Fusarium spp. et de Rhizoctonia violacea.

Colletotrichum trifolii est un champignon pathogène responsable de l’anthracnose de la luzerne. Auparavant, un gène de kinase de sérine/thréonine protéine de ce champignon (TB3), qui est un homologue fonctionnel de la kinase de COT1 Neurospora crassa, a été isolé dans notre laboratoire et semble être associé avec l’élongation des hyphes et des ramifications. Dans ce rapport, nous montrons que le traitement par la lumière induit rapidement TB3 expression et fréquence de ramification des hyphes. Analyse occidentale a montré TB3 localisation dans le cytoplasme et le noyau, mais pas dans les membranes. En outre, immunofluorescence indirecte a indiqué que TB3 niveaux étaient plus abondantes dans le noyau. Pour continuer à évaluer la distribution subcellulaire des TB3, une construction de fusion TB3:GFP a été insérée dans c. trifolii. Les résultats indiquent que la localisation cellulaire de TB3 changé pendant le développement et la croissance des champignons. Conformément à ses précédentes observations, TB3 a été localisée dans le cytoplasme et le noyau tant mais était préférentiellement localisée dans le noyau au cours de la croissance des hyphes prolongée. L’extrémité aminée de TB3 contient deux répétitions polyglutamine relativement longue. Tests à base de levure a montré que ces tracts polyglutamine peuvent activer la transcription. Ces résultats suggèrent que TB3 peut être positionné dans une cascade de signalisation réglementant la bonne croissance et le développement en fonctionnant comme un facteur de transcription.

Un trait distinctif de champignons filamenteux est leur mode de croissance et de développement via propagagules végétative appelés hyphes. Les hyphes croissent de façon polarisée et compte, en partie, pour la réussite de quête de champignons saprophytes ou pathogènes. Contrôle coordonné de la croissance et le développement des champignons filamenteux est obtenu en activant des cascades de signalisation intracellulaires en réponse à des stimuli environnementaux, y compris la disponibilité des nutriments, la lumière et la plante hôte. En plus de ces signaux environnementaux qui influencent la croissance des hyphes, facteurs génétiques ont aussi été identifiés. Chez Neurospora crassa, la sérine/thréonine kinase, COT1, s’est avéré être exigé pour l’élongation des hyphes (29). Lit bébé-1 les mutations sont thermosensible ; colonial pousse à ou supérieure à 32° C, tandis que la croissance radiale normale est égale ou inférieure à 25° C (17). En outre, perturbation des cot-1 résultats en croissance sévère vices qui discutant croître peu, voire pas du tout. lit bébé-1 expression est également photoinducible et lumière éclairage augmente la cellule apicale de hyphes ramifiées fréquence (16). Immunoblotting COT1 anticorps détecte la kinase COT1 dans le cytoplasme, la membrane et le noyau (13).

Colletotrichum trifolii est l’agent causal de l’anthracnose (1) de la luzerne. Pathogénicité de c. trifolii dépend de bonne croissance et appressorium la différenciation, qui sont censés être réglementée par l’activation des voies de transduction de signaux intracellulaires en réponse à des stimuli de l’hôte (9). Toutefois, notre compréhension des gènes et des voies biochimiques qui régissent la morphogenèse et croissance des hyphes ne sont pas entièrement claires. Auparavant, nous avons cloné et caractérisé un gène de la kinase de la sérine/thréonine protéine, tb3 (3), et la séquence des acides aminés est semblable à la séquence COT1 (70,4 % d’identité). Les domaines de la carboxy-terminal de TB3 et COT1 sont hautement conservées mais les régions Amino-terminale divergent, et dans TB3, une région particulièrement distincte contenant homopolymeric glutamine répète est présent qui n’est pas trouvé dans COT1. Même avec la divergence structurelle entre les prédit cot-1 et des produits géniques tb3 , tb3 complété le mutant de cot-1 de N. crassa, démontrant la conservation fonctionnelle de cette kinase entre un pathogène et un champignon saprophyte (3). Cette conservation entre les kinases TB3 et COT1 suggère que les mécanismes qui régulent la croissance et la ramification pourraient être similaires dans ces champignons, malgré le fait qu’ils ont des modes de vie très différents (pathogènes et saprophytes, respectivement). En plus de N. crassa cot-1, plusieurs autres homologues de kinase de TB3 ont été identifiés. Le gène Ustilago maydis ukc1 joue un rôle important dans la morphogenèse, pathogenèse et la pigmentation de ce champignon. Perturbation du gène ukc1 modifie la morphologie cellulaire, bloque la formation des hyphes aériens et favorise le développement de cellules pigmentées (10). La famille TB3/COT1 s’étend aussi bien chez les eucaryotes supérieurs. Dans la levure de fission Schizosaccharomyces pombe, la protéine-kinase orb6 -codé est nécessaire pour maintenir la polarité cellulaire pendant l’interphase (26). Les Drosophila melanogaster de gène suppresseur tumeur verrues contrôle le montant et la prolifération cellulaire et est requis pour la morphogenèse normale (14). Mutations dans l’humain homologue de TB3 (HEPATO) entraînent la Dystrophie myotonique (20). Il est donc évident que l’expression appropriée de conservée TB3-like kinases est requise pour la croissance des cellules normales et de la différenciation à travers de grandes distances taxonomiques.

Dans le présent rapport, que nous montrons que, comme COT1, TB3 expression est aussi lumière inductible. En outre, nous avons examiné la localisation de TB3 à différents stades de développement en c. trifolii. Contrairement à COT1, TB3 peut localiser dans le noyau au cours de la croissance des hyphes. En outre, dans les études employant l’expression du gène rapporteur dans la levure, nous montrons que la kinase TB3 et plus précisément la région polyglutamine riche, est capable d’activer la transcription.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Souches, des médias et des conditions de croissance.

La souche sauvage de c. trifolii course 1 (7) a été utilisée tout au long de cette étude. C. trifolii cultures ont été systématiquement cultivées à 25 ° C sur gélose YPSS (28). Pour l’isolement de protoplastes, ADN, ARN et protéines, mycélium ont été cultivés en stationnaire YPSS liquide pendant 3 à 7 jours. Conidies, germination des conidies et appressoria mycéliums ont été recueillis comme décrit ailleurs (27). Les spores et le mycélium sporulant ont été récoltés sur les cultures agitées cultivées pendant 4 à 5 jours. Par l’ensemencement de 10 ml d’une suspension de spores (10⁵ à 10⁶ spores/ml) en verre stérile pétri, germination des conidies ont été obtenus en environ 3 h et appressoria se sont formées après 6 h. souche d’Escherichia coli DH5α (GIBCO BRL) a été utilisée pour la transformation de l’ADN de plasmide. Les souches d’e. coli ont été cultivées dans un milieu Luria-Bertani ou 2xYT avec 100 μg de carbénicilline / ml si nécessaire (21).

Techniques d’acides nucléiques, amplification par PCR et séquençage de l’ADN.

Techniques standard étaient employées dans le clonage et la production de plasmides recombinants (21). L’ADN a été amplifié par Pfu polymérase essentiellement celle indiquée par le fabricant (Stratagene). L’ADN a été séquencé par la méthode de fin de chaîne de didésoxy (22). De Northern blot ARN total a été isolée de conidies, germination des conidies et mycéliums appressoria dans le réactif de TRIzol (GIBCO-BRL) selon les instructions du fabricant. Aliquotes (30 μg) d’ARN ont été chargés sur 1 % de formaldéhyde dénaturation des gels dans la mémoire tampon acide morpholinepropanesulfonic × 1 et transférés sur une membrane de nylon chargé (21). Taches de RNA ont été hybridés dans 7 % sodium dodécyl sulfate (SDS), 0,5 M Na₂HPO₄ (pH 7,2) et 2 mM EDTA. Les filtres ont été hybridées à 65° C durant la nuit et lavés comme suit : une fois pendant 10 min à température ambiante (RT) avec une solution de lavage basse-rigueur (40 mM Na₂HPO₄ [pH 7,2], 0,5 % albumine de sérum [BSA], EDTA 1 mM, SDS de 5 %) suivie de 10 min à RT et deux lavages de 10 min à 65 ° C avec une solution de lavage haute-rigueur (40 mM Na₂HPO₄ [pH 7,2], 1 mM EDTA, SDS de 1 %). Un fragment d’ADN ribosomal 25 s de Colletotrichum gloeosporioides (23) a été utilisé comme sonde pour assurer une charge équivalente de l’ARN.

Analyse de l’Ouest.

C. trifolii mycéliums ont été récoltés et immédiatement congelés dans l’azote liquide, au sol à une poudre fine avec un mortier et un pilon et en suspension dans le tampon d’extraction (5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EGTA, 0,5 % Triton, 0,3 % de β-mercaptoéthanol, et inhibiteur de la protéase fongique cocktail [PIC ; Sigma]). Après 30 min d’incubation sur la glace, des échantillons ont été centrifugés à 3 000 à 5 000 x g pendant 15 minutes et le surnageant a été placé dans un nouveau tube. Concentrations de protéine sont déterminées par la méthode de Bradford (2). Des échantillons de protéine (35 μg/lane) furent électrophorétiquement séparés et transférés à des filtres de nitrocellulose. Les anticorps TB3 utilisés pour immunoblotting ont été préparés contre un peptide de 17 acides aminés d’un segment de TB3 interne avec 100 % d’identité à COT1. Signaux ont été détectés par le système de l’ECL (Amersham).

Induction de la lumière.

Environ 10⁷ conidies/ml ont été inoculés dans 75 ml de milieu YPSS, et les cultures ont été cultivées à RT pendant 12 h avec agitation (200 tr/min) et autres incubés pendant 2 à 3 jours sans agitation afin de promouvoir la croissance végétative. Mycélium ont été récoltés par filtration, et les coussinets de mycéliums qui en résultent ont été réduits de moitié et soit brièvement éclairé par la lumière blanche saturante (énergie couramment taux ≥ 1,7 W/m² dans la région bleue) ou conservés dans l’obscurité comme un contrôle. Des expositions claires et sombres ont été résiliées par surgélation les mycéliens touches dans l’azote liquide. L’ARN total a été extrait comme précédemment décrit et utilisé pour l’analyse du Nord.

Pour évaluer l’effet de la lumière sur la croissance et le développement, lames de microscope de verre stériles ont été superposées d’une fine couche (environ 2 mm) de gélose YPSS fondu. Une partie aliquote de 20 μl d’une suspension de spores contenant 0,5 × 10⁶ spores / ml a été placé à une extrémité de chaque diapositive et puis strié dans la gélose pour assurer une répartition égale des spores. Les diapositives inoculés étaient alors mis dans des plats de pétri plastique 150 mm de diamètre, qui ont été ensuite placés dans une boîte en plastique contenant une éponge saturée d’eau, et la zone était couverte d’une pellicule de plastique pour assurer un environnement humide. Les cultures ont été incubées dans un incubateur éclairé. Pour le contrôle sombre, pétri étaient recouverts de papier d’aluminium. Une lamelle a été placée sur les colonies qui en résultent, et points dans le temps sélectionné suivant les cultures ont été examinés à l’aide d’un microscope Zeiss avec optique (DIC) de contraste interférentiel différentiel. Images capturés grâce à une caméra à dispositif à couplage de charge, traitement à l’aide d’Image-Pro Plus 3.0 pour Windows (média cybernétique).

Construction des fusions de TB3::GFP et des vecteurs d’expression de levure.

Pour examiner la distribution subcellulaire des TB3, cDNA TB3 dont 460 bp de séquence en amont a été translationnelle fusionné au gène de la protéine fluorescente verte (GFP) (24). Un fragment d’ADN de TB3 2,6-Ko a été amplifié de l’ADNc fongique par PCR avec les paires d’amorces spécifiques suivantes qui génèrent des EcoRI et BamHI sites aux extrémités 5′, respectivement : apprêt TB3-F, 5′-CGGAATTCATTAGTGCCAGCGGGTTG ; apprêt TB3-R, 5′-CGGGATCCACGGAAGTTGTTGTCG. Le fragment PCR qui en résulte s’étend sur l’extrémité 5′ du promoteur TB3 et l’extrémité 3′ de la trame de lecture ouverte TB3 (ORF). PCT74 contenant GFP (SGFP-TYG) a été utilisé, et un fragment d’ADN de 1,4 kb a été généré par PCR avec des amorces supplémentaires suivants contenant un BamHI et XbaI du site à la gare de termini 5′, respectivement : apprêt SGFP-F, 5′-CGGGATCCAATCCCATGGTGA ; apprêt SGFP-R, 5′-GCTCTAGATTCTCATGTTTGAC). Pour la construction de la fusion de TB3:GFP, le fragment d’ADN de 2,6 kb EcoRI et BamHI clivage a été cloné dans l’EcoRI /BamHI site de vecteur pBluescript SK pour donner le plasmide pTB3-1. Le 1,4 kb BamHI /XbaI ADN fragment était ligué dans le BamHI /XbaI site de pTB3-1 afin de créer des pTB3-2, qui a codé une fusion TB3:GFP composé de 2,6 kb de la TB3 séquence en amont et ORF pleine longueur fusionnés dans le cadre avec le gène rapporteur machiné de GFP. La fusion translationnelle correcte a été confirmée par l’analyse de séquences d’ADN. La cassette de gènes de résistance hygromycine B a été excisée de pCT74 et liguée dans le Sal, j’ai du site de pTB3-2 pour donner le plasmide pTB3-3. pTB3-3 contenant la fusion de TB3:GFP et le gène de résistance à l’hygromycine pour la sélection a été transformée dans des protoplastes de c. trifolii comme décrit plus haut (27).

Dosage de la phosphatase.

Les hyphes ont été récoltés par l’inoculation de 500 ml de YPSS dans un ballon jaugé de 1 litre avec un ≈15-mm³ fiche d’agar-mycélium de c. trifolii obtenus à partir de la marge de progresse d’une culture YPSS. Cette culture liquide a été incubée à RT, avec agitation constante à 200 tr/min, pendant 2 jours et ensuite incubée pour une supplémentaire de 3 à 6 jours sans agitation. La culture a été récoltée par filtration et lyophilisée. Les échantillons séchés ont été broyés en poudre dans l’azote liquide et suspendu à 300 μl de tampon d’extraction (5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EGTA, 0,5 % Triton, 0,3 % de β-mercaptoéthanol et PIC fongique). Après 30 min d’incubation sur la glace, des échantillons ont été centrifugés à 3 000 à 5 000 x g pendant 15 minutes, et le surnageant a été placé dans un nouveau tube. Concentrations de protéine sont déterminées par la méthode de Bradford (2). Une partie aliquote des extraits cellulaires est incubée pendant 1 h à 30° C à 100 μl de 50 mM Tris, EDTA de 0,1 mM, 5 mM dithiothréitol, 0,01 % Brij 35, pH 7.5, en présence ou en absence de 400 U de lambda protéine phosphatase (New England Biolabs). Les échantillons ont été séparés par électrophorèse sur gel et soit colorées au bleu de Coomassie ou détectées par Western Blot avec TB3 anticorps.

RÉSULTATS

Lumière augmente la fréquence de ramification des hyphes et TB3 expression dans c. trifolii.

Lumière s’est avérée être un signal important régissant les programmes de perfectionnement chez les champignons filamenteux (16). Afin d’évaluer les effets de la lumière sur la croissance des hyphes c. trifolii et le développement, les spores ont été inoculés sur lames de microscope de verre stériles contenant une fine couche de gélose YPSS et cultivées en présence ou en absence de lumière constante. Une évolution temporelle a été réalisée avec divers intervalles de traitement par la lumière, et le nombre de branches du tube germinatif original a été enregistré à 6 h après la germination (Fig. ?(Fig.1A).1 A). Figure ?Figure1B1 B montre des hyphes ramifiés périodes suivantes 6 et 10 h illumination. Résultats indiquent qu’éclairage augmenté apicale fréquence de ramification des hyphes.

FIG. 1.

Effet de lumière sur la morphologie des hyphes dans c. trifolii. (A) les spores ont été inoculés sur lames de microscope de verre stériles d’une fine couche de gélose YPSS et cultivées dans une lumière constante ou dans l’obscurité complète (contrôle). Suite à des intervalles de temps indiqués, le nombre de branches du tube germinatif original a été enregistré à 6 h après la germination. Les résultats représentent le moyen (± écart) de trois expériences distinctes. (B) périodes illumination des hyphes ramifiées suivant 6 et 10 h. Cultures ont été observés à l’aide de DIC. Barres, 20 μm.

Nous avons ensuite examiné l’effet de la lumière sur l’expression tb3 . Mycélium ont été cultivés en YPSS et exposé à la lumière pour différents intervalles de temps. ARN et des protéines ont été extraits des échantillons de mycéliums, et l’expression de tb3 a été suivie par Northern et Western Blot (Fig. ?(Fig.2A2 A et B, respectivement). Quant à N. crassa cot-1, expression tb3 était aussi lumière inductible. Après 15 min d’exposition à la lumière, des niveaux élevés de tb3 transcription on a observé une blanche. niveaux de transcription TB3 abaissé après 30 min d’illumination et ont chuté sous l’éclairage délai porté. Cohérent avec les changements dans les niveaux d’ARNm, les concentrations de protéines TB3 a culminé après 30 min d’exposition à la lumière. TB3 expression demeure constante dans la pénombre. Ces résultats montrent une corrélation entre la lumière, l’expression de tb3 et ramification des hyphes. Dans ces expériences, deux formes immunoréactives de la TB3 protéine (≈76 et ≈85 kDa) ont été détectés (Fig. ?(Fig.2B).2 B). La protéine ≈76 kDa correspond à la séquence d’acides aminés, basée sur la séquence du gène tb3 .

FIG. 2.

Règlement clair d’expression TB3 dans c. trifolii. Mycélium ont été cultivées pendant la nuit dans l’obscurité dans un milieu YPSS et récoltées par filtration. Les coussinets de mycéliums ont été réduits de moitié et soit illuminée (L lanes) pour 15, 30 ou 60 min ou maintenus à l’obscurité (voies D). Traitements de lumière et l’obscurité ont été résiliés par surgélation les mycéliens touches dans l’azote liquide. (A) les taches du Nord de l’ARN total (30 μg/lane) préparé à partir des mycéliums c. trifolii après exposition à la lumière, avec TB3 comme sonde. Le fragment d’ADN ribosomal 25 s de c. gloeosporioides permettait d’afficher la charge équivalente de RNA. (B) Western blots de lysats (35 μg de protéines par voie) préparés à partir du mycélium même traité comme protéine de panneau A. TB3 a été détectée avec TB3 anticorps.

Expression développementale de TB3.

Résultats antérieurs (3) ont montré que tb3 ARNm plus fortement exprimé 1 h après la germination des conidies sous induisant des conditions (surface dure et médias riches en nutriments). Afin de caractériser des modèles d’expression de TB3, TB3 équilibre protéine niveaux ont été comparés au cours des divers stades de développement fongiques. Taux de base de TB3 ont été observés dans les conidies et la germination des conidies (Fig. ?(Fig.3,3 voies 1 et 2). TB3 expression n’a pas été détectée dans appressoria (Fig. ?(Fig.3,3 piste 3). Les plus hauts niveaux d’expression TB3 ont été observés au cours de la croissance des hyphes (Fig. ?(Fig.3,3 voies 4 et 5). Ces données suggèrent que TB3 est requise durant la croissance proliférative et n’est pas nécessaire ou vers le bas réglementé durant la croissance isotrope ou non polaire. Fait intéressant, les deux formes immunoréactives de TB3 ont été détectées par les anticorps TB3 en culture mycélienne encore, mais pas à secouer la culture (Fig. ?(Fig.3,3 voies 4 et 5).

FIG. 3.

Analyse occidentale du développement de c. trifolii TB3. Des concentrations équivalentes de totales protéines fongiques ont été utilisées, tel que déterminé par des essais de Bradford (2). Lane 1, conidies ; allée 2, germination des conidies ; piste 3, appressoria mature ; piste 4, mycélium secouer la culture ; voie 5, de la culture mycélienne encore.

Traitement de la protéine TB3 avec phosphatase.

Comme mentionné, deux formes de protéine TB3 (de ≈76 et ≈85 kDa) ont été détectés dans les hyphes en croissance encore culture (Fig. ?(Fig.2B2 B et ?et 3,3 voie 5). Afin de vérifier si ces différentes formes de migration de TB3 sont dus aux États différents de la phosphorylation, aliquotes d’extraits protéiques ont été incubées en présence de phosphatase de lambda et analysées par Western Blot. Traitement de la phosphatase élimine la bande ≈85-kDa, suggérant que la modification post-traductionnelle de TB3 par phosphorylation se produit et peut être responsable de la différence de migration des bandes de deux protéines (Fig. ?(Fig.44).

FIG. 4.

Ouvrir dans une fenêtre séparée

FIG. 5.

Localisation de TB3 : immunoblotting.

Trois différentes préparations subcellulaires y compris cytoplasmique, membrane et fractions nucléaires ont été extraites des mycéliums c. trifolii . Analyse occidentale (fig.) ?(Fig.6)6) a indiqué que TB3 était présente dans les deux fractions nucléaires et cytoplasmiques (voies A et B, respectivement), mais il était indétectable dans les fractions membranaires (voie C).

FIG. 6.

TB3 distribution dans les fractions subcellulaires de c. trifolii. Nucléaire (A), cytoplasmique (B) et (C) les fractions membranaires ont été préparées à partir d’hyphes cultivés pendant 2 à 3 jours sous agitation constante, et protéines totales ont été hybridées avec TB3 anticorps par analyse occidentale.

Localisation de TB3 : gène rapporteur.

Un vecteur plasmidique a été construit dans lequel GFP a été fusionnée à pleine longueur tb3 sous le contrôle du promoteur tb3 . Après transformation, 25 souches résistant à l’hygromycine exprimant la fusion de TB3::GFP ont été isolées et 10 insertion simple copie indépendante transformant (déterminés par transfert de Southern) (données non présentées) ont été examinées par microscopie à fluorescence. L’ADN nucléaire était taché au DAPI. Comparaison de la fluorescence GFP (Fig. ?(Fig.7a7 a à d) avec fluorescence DAPI (Fig. 7e à h) a montré que TB3 localisation variait selon le stade de développement. Au cours de la conidiation, TB3 était essentiellement cytoplasmique (Fig. 7 a et e). Comme les tubes germinatifs allongent, TB3 protéines étaient concentrées dans les régions à proximité de membranes (Fig. 7 b et f). Dans les hyphes cultivés pendant 2 à 4 jours, TB3 est apparu dans le cytoplasme avec peu de fluorescence dans le noyau (fig.) 7c et g), mais comme la croissance des hyphes augmenté au protéines de 1 semaine temps TB3 trouvées principalement dans le noyau (fig.) 7d et h).

FIG. 7.

Distribution cellulaire des protéines de fusion TB3:GFP. Protéines de fusion de GFP-TB3 ont été sauvage c. trifolii, et les cellules ont été observées comme indiqué dans la légende de figue. ?Fig. 5.5. Hyphes, les hyphes cultivés pendant 2 à 3 jours ; Hyphes, les hyphes cultivés pendant 1 semaine. Barres, 10 μm.

Activité transcriptionnelle de TB3 protéine dans la levure.

Le domaine réglementaire N-terminal de TB3 contienne deux relativement longues étendues des résidus glutamine (32 43 résidus) ; Il s’agit d’une distinction principale et peut-être importante entre les kinases c. trifolii TB3 et N. crassa COT1 (3). Polyglutamine étendues sont associés avec la médiation des interactions protéine-protéine, impliquant souvent l’activation transcriptionnelle (12, 25). Couplé avec l’observation que TB3 était localisée dans le noyau, nous nous sommes intéressés à déterminer si TB3 et plus précisément la région riche en polyglutamine peuvent activer la transcription. TB3 activation de la transcription a été évaluée par conséquent dans la levure. L’ORF TB3 pleine longueur et les tracts de polyglutamine TB3 ont été fusionnés dans le domaine de fixation à l’ADN de GAL4 (GAL4BD-TB3GLU et GAL4BD-TB3FL), respectivement et transformés en levure Y190. Les transformants cultivés sur SD/Gal/Raf /-Trp avait activité β-galactosidase (Fig. ?(Fig.8).8). L’activité β-galactosidase dans les transformants TB3GLU tronqués a été plue élevée que chez les transformants TB3FL pleine longueur. Ainsi, le DVD complet TB3 ainsi que les tracts polyglutamine TB3 pourraient activer la transcription chez les levures, mais les tracts de glutamine seuls sont plus efficaces dans l’activation de transcription.

FIG. 8.

(A) analyse de l’activité β-Galactosidase par dosage de levure colonie filtre. Levures ont été transformés par pAS2-1, pGAL4BD-TB3FL ou pGAL4BD-TB3GLU et cultivé sur des plaques de SD/Gal/Raf /-T. La couleur bleue est révélatrice de l’activité β-galactosidase exprimée par la levure. B analyses de l’activité β-Galactosidase dans un test ONPG de levure. Les données représentent le moyen (± écart) de trois expériences distinctes.

DISCUSSION

Toutes les cellules vivantes, détecter et réagir aux signaux environnementaux. Mycélium étant le principal moyen par lequel les champignons fourragères pour les éléments nutritifs, une réglementation adéquate des hyphes est extrêmement importante. Chez les champignons filamenteux, lumière a été connue pour jouer un rôle clé dans la conidiation tant la croissance végétative. Par exemple, les conidies du Colletotrichum graminicola est dépendante de la lumière. Obscurité des cultures de ce champignon ont une morphologie de colonie des hyphes moelleux et sont incapables de conidies de forme, alors que l’éclairage de ces cultures se traduit par des conidies abondantes avec moins d’hyphes (J. Wang et R. M. Hanau, 18e Genet fongiques. Conf., affiche 37, 1995). La phase végétative de N. crassa est, en partie, régulée par la lumière bleue qui, comme nous l’avons, stimule des hyphes ramifiée fréquence (16). Dans cet article, nous montrons que l’expression de la kinase c. trifolii TB3 était induite par l’illumination et corrélée à une augmentation de la ramification des hyphes. Les données présentées ici témoignent d’une relation entre la croissance des hyphes, expression de TB3 et lumière. Comme pour N. crassa, éclairement lumineux augmentation de la fréquence de ramification des hyphes apicale dans c. trifolii, suggérant un rôle pour la lumière dans la prolifération des hyphes. Des études antérieures ont démontré que N. crassa COT1 est requise pour l’élongation des hyphes et des ramifications, et perturbation de cot-1 empêche la croissance des hyphes (29). Puisque c. trifolii tb3 complété le mutant cot1 à la croissance normale des hyphes (3) et puisque la lumière influencé des hyphes ramifiée fréquence et TB3 expression similaire à que COT1, il est raisonnable de l’hypothèse que TB3 peut fonction permettant de réguler la croissance des hyphes dans c. trifolii d’une manière similaire à celle de COT1. Interruption du gène tb3 dans c. trifolii est en cours.

Comme illustré à la figure. ?Fig. 3,3, L’expression TB3 a été régulée au cours de la morphogenèse. Des niveaux plus élevés de protéines TB3 trouvées au cours de la croissance des hyphes, mais n’étaient pas détectables au cours de la formation de l’appressorium (Fig. ?(Fig.3,3 piste 3). Appressoria sont hautement différenciés et développer en tant que division cellulaire cesse. Le règlement bas de TB3 dans le développement de l’appressorium, couplé à l’induction de l’expression au cours de la croissance des hyphes, suggère que TB3 affecte la croissance proliférative.

Chez N. crassa, deux isoformes COT1 (≈73 et ≈67 kDa) sont exprimés dans la sauvage et lit bébé-1 souches cultivées à température permissive (25 ° C). L’isoforme de faible masse moléculaire n’a pas été détecté dans cot-1 souches cultivées à des températures restrictives. Fait intéressant, suite à un changement de restrictif à températures permissives, l’isoforme de COT1 ≈67 kDa est réapparu (13), qui a suggéré que cette isoforme peut être exigé pour ou réglementer l’allongement des hyphes. Conformément à l’expression de N. crassa COT1, TB3 anticorps détectés aussi deux isoformes de kinase TB3 (≈76 et ≈85 kDa) facilement observés en culture stationnaire (Fig. ?(Fig.2B2 B et ?et 3,3 voie 5). Sans compter que le peptide ≈76 kDa, qui correspond à la séquence d’acides aminés, la présence unique de l’isoforme de TB3 ≈85-kDa de poids moléculaire plus élevé en culture stationnaire peut être fonctionnellement importante. Protein phosphorylation-déphosphorylation est une modification post-traductionnelle commune régissant les voies de transduction de signal (8), nous avons examiné si cette modification était responsable de ces isoformes TB3. Les résultats indiquent que la forme de poids moléculaire plus élevé de protéine TB3 (≈85 kDa) a disparu après le traitement de la phosphatase. En vertu de la croissance sans conditions, c. trifolii pousse presque exclusivement par voie végétative, ce qui suggère que l’isoforme de TB3 ≈85 kDa peut-être être impliqué dans la régulation de la croissance des hyphes.

Fait intéressant, le dosage de l’immunotransfert détecté seulement la protéine ≈76 kDa, avec un niveau supérieur dans la fraction cytoplasmique que dans la fraction nucléaire. Nous croyons que c’est en raison du point de temps au début de la récolte de l’échantillon et la spécificité de l’anticorps. TB3 anticorps détecte uniquement la protéine ≈76 kDa dans la culture de secouer, avec TB3 largement distribué dans le cytoplasme au cours des premières périodes de croissance (2 à 3 jours). Dans l’essai immunoblotting, les échantillons ont été récoltés plus tard dans la période croissante (voir les matériaux et méthodes).

Deux étendues de polyglutamine résidus sont retrouvent dans le domaine réglementaire N-terminal de c. trifolii TB3 mais pas chez N. crassa COT1 ou fission levure ORB6 (3, 10, 29). Homopolymeric étendues de glutamine ne sont pas rares et ont été trouvés dans un certain nombre de facteurs de transcription chez les mammifères (5, 6, 11, 12, 25). En outre, des études récentes ont montré que les homopolymeric étendues de glutamate sont retrouvent également dans d’autres protéines kinases de sérine/thréonine qui ont un degré élevé de similitude avec c. trifolii TB3. U. maydis ukc1 encode deux tracts de glutamine homopolymeric dans le N-terminal un tiers du polypeptide (10). Les régions riches en glutamine se trouvent également dans le polypeptide codé par les Drosophila tumor suppressor gène verrues (14). S’il est tentant de supposer que ces produits agissent comme activateurs de la transcriptionnelles, le rôle des régions hautement conservées n’a pas encore été déterminé dans l’un des membres de la famille TB3. Ici, nous avons utilisé un système de deux-hybride de levure pour examiner si TB3 avait la capacité d’activation de la transcription. L’activité β-Galactosidase a été détectée dans les cellules de levure transformées avec les constructions de fusion TB3GLU-GAL4BD ou TB3FL-GAL4BD. Nous avons également constaté que l’activité β-galactosidase dans les transformants (TB3 polyglutamine répétitions) de TB3GLU était plus élevée que dans le TB3FL (pleine longueur TB3) transformants, bien que ces deux activités aient été nettement inférieur à celui du contrôle positif de levure. Ces données indiquent que TB3FL et TB3GLU stimulent la transcription chez les levures. Les différentes activités entre les constructions de pleine longueur et polyglutamine pourraient être due aux différences dans la conformation des protéines. TB3GLU se compose de seulement 95 acides aminés et contient seulement deux étendues de polyglutamine répétitions. Il est probable que la fusion de TB3GLU-GAL4BD lie plus facilement à des facteurs de transcription et qu’il est plus active. Alternativement, la protéine entière peut contenir des éléments qui modulent négativement la capacité de transactivation qui ne sont pas présents dans la construction tronquée. Ainsi, basé sur l’activation de la transcription de TB3 chez les levures, TB3 localisation nucléaire peut-être avoir un rapport fonctionnel.

Résidus de 229 à 232 (KRAR) de la protéine TB3 soutenant cette idée, satisfont à l’exigence d’un signal de localisation nucléaire minimale (NLS) en ayant la séquence tétramère K(R/K) X(R/K), où X est K, R, P, V ou A (4). Flanquant la NLS putatif est des sites potentiels de phosphorylation. Conformément à un NLS dans la séquence des acides aminés est le fait que TB3 a été retrouvé dans le noyau. Microscopie par immunofluorescence indirecte ont montré des signaux TB3 dans les noyaux et analyse Western a montré la protéine TB3 dans les deux fractions du nucléaires et cytoplasmiques des hyphes. En outre, c. trifolii transformée avec une construction de fusion TB3:GFP a montré forte fluorescence nucléaire dans les hyphes plus âgés. Ces observations sont contrairement aux études chez N. crassa où la protéine COT1 a été principalement associée aux fractions membranaires et dispersés dans le cytoplasme, mais a été trouvée seulement dans les fractions cytoplasmiques quand un mutant de cot-1 a été cultivé à des températures restrictives (13). Nos preuves suggèrent donc que TB3 peut être un facteur de transcription médiation voies de réponse dépendante de la lumière impliquées dans le développement et la croissance des hyphes fongique.